細胞色素P450亞酶1A2，簡稱為CYP1A2，是肝細胞微粒體復合功能氧化酶系統(tǒng)的成員之一，也是芳香族碳氫化合物加羥基酶（aryl hydrocarbon hydrorylase；AHH）的成員之一。在人體肝臟里占P450酶系15％。與CYP1A1高度同源，特別是在外顯子2、4、5和6。CYP1A2由多個多態(tài)性變體，最常見的是：1A和1F，與咖啡因代謝和遲發(fā)性皮膚卟啉癥（porphyria cutanea tarda）相關。CYP1A2的作用在于體內(nèi)外源化合物

（xenobiotics），包括藥物、致癌劑、化學污染物的氧化代謝，即單加氧化作用（monooxygenation）和羥化
作用（hydroxylation）,以及脂類合成包括膽固醇和類固醇。芳香族碳氫化合物誘導CYP1A2的表達。甲氧基異酚噁唑脫甲基酶（7-methoxyresorufin-O-demethylase；MROD）的活性是細胞色素P450亞酶1A2的診斷標記，其基于MROD選擇性催化細胞色素P450亞酶1A2的活性。甲氧基異酚噁唑（7-methoxyresorufin）在甲氧基異酚噁唑脫甲基酶的催化下，轉化為羥基異吩噁唑酮（resorufin）后熒光峰值的變化（激發(fā)波長530nm， 散發(fā)波長590nm），來定量測定細胞色素P450亞酶1A2的活性。甲氧基異酚噁唑脫甲基酶反應系統(tǒng)為：
 
 
 

產(chǎn)品內(nèi)容

 
HEPENGBIO 緩沖液（Reagent A） 毫升
HEPENGBIO 反應液（Reagent B） 毫升
HEPENGBIO 底物液（Reagent C） 微升
HEPENGBIO 標準液（Reagent D） 微升
產(chǎn)品說明書 1 份
 

保存方式

 
保存在－20℃冰箱里，HEPENGBIO 底物液（Reagent C）和 HEPENGBIO 標準液（Reagent D）避免光照， 有效保證 6 月
 

用戶自備

 
1.5 毫升離心管：用于標準樣品操作的容器恒溫水槽：用于孵育反應
比色皿或黑色 96 孔板：用于反應和熒光分析的容器熒光分光光度儀或熒光酶標儀：用于熒光分析
 

實驗步驟

 
實驗開始前，將－20℃冰箱里的試劑置入冰槽里融化。然后進行下列操作。一、 測定準備
1. 準備好待測樣品（例如細胞裂解萃取液或微粒體樣品等），置于冰槽里
2. 設定好熒光分光光度儀（溫度為 37℃）：激發(fā)波長 530nm，散發(fā)波長 590nm，并置零
3. 準備好 5 個 1.5 毫升離心管，標記為 1 至 5 號管
4. 加入 xx 微升 HEPENGBIO 緩沖液（Reagent A）到 1 號管
5. 分別加入 xx 微升 HEPENGBIO 緩沖液（Reagent A）到 2 至 5 號管
6. 移取 xx 微升 HEPENGBIO 標準液（Reagent D）到 1 號管，混勻
7. 小心移取 xx 微升 1 號管稀釋的 HEPENGBIO 標準液（Reagent D）到 2 號管，混勻
8. 小心移取 xx 微升 2 號管稀釋的 HEPENGBIO 標準液（Reagent D）到 3 號管，混勻
9. 小心移取 xx 微升 3 號管稀釋的 HEPENGBIO 標準液（Reagent D）到 4 號管，混勻
10. 將 1 至 5 號管放進冰槽里備用，避免光照；標準管濃度見下表
 

管號	HEPENGBIO 緩沖液（Reagent A）	HEPENGBIO 標準液（Reagent D）	標準羥基異吩噁唑酮濃度
1	xx 微升	xx 微升	xx 納摩爾/升
2	xx 微升	xx 微升 1 號管	xx 納摩爾/升
3	xx 微升	xx 微升 2 號管	xx 納摩爾/升
4	xx 微升	xx 微升 3 號管	xx 納摩爾/升
5	xx 微升	0	0

 

二、 標準曲線測定

 
 
1. 移取 xx 微升 HEPENGBIO 緩沖液（Reagent A）到新的比色皿
2. 加入 xx 微升 HEPENGBIO 反應液（Reagent B）
3. 加入 xx 微升 HEPENGBIO 底物液（Reagent C）
4. 加入 100 微升上述配制的標準液
5. 上下傾倒數(shù)次，混勻
6. 在 37℃溫度下孵育 10 分鐘
7. 即刻放進熒光分光光度儀檢測獲得相對熒光單位
8. 重復實驗步驟 1 至 7 四次
9. 構建標準曲線：縱座標（Y 軸）為相對熒光單位；橫座標（X 軸）為標準羥基異吩噁唑酮濃度（納摩爾/升）

三、 樣品測定

 
 
1. 移取 xx 微升 HEPENGBIO 緩沖液（Reagent A）到新的比色皿
2. 加入 xx 微升 HEPENGBIO 反應液（Reagent B）
3. 加入 xx 微升 HEPENGBIO 底物液（Reagent C）
4. 加入 100 微升待測樣品（20 微克微粒體蛋白或 100 微克細胞裂解萃取液蛋白）（注意：樣品須清澈）
5. 上下傾倒數(shù)次，混勻
6. 在 37℃溫度下孵育 10 分鐘
7. 即刻放進熒光分光光度儀檢測：獲得相對熒光單位
8. 根據(jù)標準曲線獲得樣品對應羥基異吩噁唑酮濃度（納摩爾/升） 四、 計算樣品活性
 

五、 熒光酶標儀測定

 
 
1. 在黑色 96 孔板上做好相應標記：標準樣品和待測樣品
2. 分別移取 xx 微升 HEPENGBIO 緩沖液（Reagent A）到相應孔里
3. 分別加入 xx 微升 HEPENGBIO 反應液（Reagent B）
4. 分別加入 xx 微升 HEPENGBIO 底物液（Reagent C）
5. 分別加入 25 微升上述配制的標準液或待測樣品（20 微克微粒體蛋白或 100 微克細胞裂解萃取液蛋白）
（注意：樣品須清澈）
6. 輕輕搖動黑色 96 孔板
7. 在 37℃溫度下孵育 10 分鐘
8. 即刻放進熒光酶標儀檢測：獲得相對熒光單位
9. 構建標準曲線：縱座標（Y 軸）為相對熒光單位；橫座標（X 軸）為標準羥基異吩噁唑酮濃度（納摩爾/升）
10. 根據(jù)標準曲線獲得樣品對應羥基異吩噁唑酮濃度（納摩爾/升）
11. 活性計算：
 
 

注意事項

 
1. 本產(chǎn)品為 25 次（比色皿）或 85 次（黑色 96 孔板）操作，包括標準液
2. 操作時，須戴手套
3. 系統(tǒng)操作過程中，標準液測定只需 1 次
4. 樣 品 須 澄 清 ， 至 關 重 要 （ 本 公 司 提 供 HEPENGBIO 細 胞 可 溶 性 總 蛋 白 質(zhì) 制 備 試 劑 盒
HEPENGBIO30002.1）
5. 熒光檢測易受到蛋白的干擾，例如牛血清白蛋白（bovine serum albumin；BSA）會與羥基異吩噁唑酮
（resorufin）結合，導致熒光讀數(shù)的降低
6. 如果樣品讀數(shù)低于背景讀數(shù)明顯，建議使用失活的樣品作為樣品背景對照，以及標準樣品測定
7. 孵育反應完成后即刻進行熒光測定
8. 如果酶活性過低，可以增加反應時間至 30 分鐘
9. 熒光測定后，比色皿須清洗徹底